哈尔滨工业大学陈西课题组近年来工作概览

副标题：纳米抗体及临近诱导的化学生物学

陈西研究员简介：哈尔滨工业大学生命科学中心/生命科学与技术学院研究员、博导、国家级高层次青年人才。2008年获四川大学学士学位，2010年硕士毕业于加坡国立大学，2012年博士毕业于德国乌尔姆大学（导师：Tanja Weil教授）。之后在马普分子生理所进行博士后研究，以及作为高级研究学者在普林斯顿大学工作，2019年回国到哈尔滨工业大学建立“化学生物学与前沿生物技术实验室”。陈西课题组的主要方向包括：（1）化学光遗传与光化学生物学，（2）纳米抗体靶向蛋白降解，以及（3）细胞骨架与肿瘤治疗。目前共发表论著逾三十篇，包括近年来发表的高水平代表论文（IF>15）多篇，如Adv. Sci.（2024）、Nat. Commun.（2023）、J. Am. Chem. Soc.（2023）、Cell Discov.（2020）、Angew. Chem. Int. Ed.（2018/ 2018 VIP paper/ 2017 HOT paper），撰写了多个专著章节（Wiley 2017/ Springer Nature 2019/ Elsevier 2022），申请了基于PCT途径的国际发明专利一项（2022），获得中国发明专利授权多项。

本文将按照时间顺序介绍陈西课题组近五年的一些代表性研究工作。

（一）WEPEAR方法实现超灵敏现场检测RNA病毒核酸

2019年底开始新冠疫情爆发，陈西课题组面向国家应急科研需求，运用临近诱导原理设计了核酸型探针，在世界范围内首次报道了基于RT-RPA恒温核酸扩增原理的高灵敏度检测SARS-CoV-2核酸的手段（Cell Discov., 2020, 6, 37）。陈西课题组提出了WEPEAR（whole-course encapsulated procedure for exponential amplification from RNA）流程，实现对病毒核酸RNA的指数型扩增与检测。例如，通过设计exo探针，可以通过检测荧光增强的方式来检测病毒核酸RNA。也可以通过设计nfo探针，将FAM抗体和生物素抗体二聚化，进而使用胶体金试纸条进行现场检测。由于不需要复杂的热循环仪，还可以通过一个普通的保温水杯即可实现居家的病毒核酸检测。实验发现，基于WEPEAR对SARS-CoV-2核酸检测能达到单拷贝灵敏度，这代表了RT-RPA在当时检测核酸的最高灵敏度。相关工作发表在高影响力杂志Cell Discovery 上。论文发表之后也获得了大量关注与引用（>100次引用），被包括Nat. Biomed. Eng.、Clin. Micro. Biol. Rev.、Angew. Chem. Int. Ed.等高水平杂志引用和点评。同时作者也获得Elsevier出版社邀请撰写了专著章节，相应技术成果也获得国家发明专利授权。

图1. 设计WEPEAR方法利用RT-ERA（改进型的逆转录—重组酶聚合酶扩增RT-RPA）而实现超灵敏现场检测RNA病毒核酸。a）RT-ERA扩增检测RNA的大体原理（RT：逆转录；ERA：指数型重组酶扩增）。b）WEPEAR流程示意图。c）智能手机拍照检测SARS-CoV-2的N基因，使用exo型绿色荧光探针。d）用荧光光谱仪检测荧光的增强，使用exo型绿色荧光探针检测N基因。e）将检测N基因的绿色exo探针与检测S基因的红色exo探针搭配实现双基因同时检测。f）一周之内即可完成引物和探针的设计并用于RNA核酸检测。g）运用nfo探针使用胶体金试纸条实现RNA核酸检测。h）DNA凝胶电泳证实了待检测基因被扩增出来。

（二）小分子偶联纳米抗体临近诱导SNACIP体系调控胞内难寻配体靶标

传统的化学诱导临近（CIP）技术存在着难以直接调控内源以及难寻配体靶标的挑战。为此陈西课题组开发出小分子偶联纳米抗体临近诱导体系SNACIP（small molecule-nanobody conjugate induced proximity），实现了对内源的和胞内难寻配体靶标的调控（Nat. Commun., 2023, 14, 1635）。例如，通过将EGFP的纳米抗体GBP与大肠杆菌二氢叶酸还原酶eDHFR的配体—甲氧苄啶TMP偶联，之后接上环状跨膜肽cR₁₀*，进而制备出通用型SNACIP诱导剂cR₁₀*-SS-GBP-TMP（cRGT）。cRGT可以快速地以非内吞的方式进入细胞（t_1/2 < 8 min），能以剂量依赖性的方式诱导eDHFR和GFP所融合蛋白的二聚化，并能被TMP可逆调控。基于SNACIP技术，陈西课题组又开发出针对内源的无配体靶标TPX2的SNACIP诱导剂cRTC和CTTC，去激活癌蛋白TPX2的功能，实现抑制癌细胞分裂，以及抑制肿瘤的增殖。相关工作发表在高影响力综合性杂志Nature Communications 上。论文发表之后受到广泛关注（近万次access），并在Springer Nature的“Behind the Paper”一栏撰文分享了这项工作，相应技术成果也获得了国家发明专利授权。

图2. SNACIP临近诱导体系。a）SNACIP诱导剂结构示意图。b）通用型SNACIP诱导剂cRGT的结构和工作原理。c）cRGT诱导eDHFR和EGFP所融合蛋白二聚化的原理示意图。d）调控癌蛋白hTPX2的SNACIP诱导剂抑制细胞分裂且抑制小鼠肿瘤增生。

（三）自噬靶向纳米抗体嵌合体降解难寻配体胞内靶标，抑制卵巢癌细胞增殖

基于自噬的靶向蛋白质降解（TPD）具有广泛的底物普适性，不仅能降解可溶蛋白，还能降解大的细胞器和致病性的聚集蛋白。然而双功能小分子蛋白降解剂难以降解无配体结合口袋的胞内靶标，为此陈西课题组开发了一种通用的、模块化的和多应用模式的自噬靶向纳米抗体嵌合体ATNC（J. Am. Chem. Soc., 2023, 145, 45），用于选择性降解细胞内难寻配体靶标。ATNC主要由两部分组成：与靶标结合的纳米抗体部分和自噬靶向部分LC3B或LIR（LC3B互作基序）多肽。该研究共设计了三种降解模式来展示ATNC技术的应用价值，各有特点和优势。第一种模式是胞内抗体（intrabody）型ATNC，通过简单的细胞转染在胞内表达ATNC嵌合体便能实现靶向降解。第二种模式是化学诱导邻近（CIP）操控的降解系统，首次实现布尔逻辑门控的靶向蛋白降解。第三种模式是携带环状穿透肽的自噬抗体（phagobody），能通过直接加药而降解胞内靶标。

图3. 基于LC3B的ANTC的设计与应用。a）基于LC3B的ATNC的工作机制示意图。b）共聚焦显微镜和WB 结果显示ATNC有效降解EGFP。c）ATNC具有模块化特征，更换纳米抗体模块即可降解不同靶标。d）双纳米抗体型ATNC实现Tiam1和RhoA之双靶标同时降解。

人附睾蛋白4（HE4）是近年来越来越受到关注的卵巢癌标志物，它是一种糖蛋白，也是不可成药靶标。为此，该研究工作开发出了自噬抗体phagobody通过加药降解内源的HE4，成功抑制了卵巢癌细胞的增殖和迁移，显示出ATNC技术在转化应用层面的潜力。该研究相关成果发表在化学权威杂志Journal of the American Chemical Society 上，并被遴选为封面文章，相应技术也已申请了中国发明专利。

图4. 自噬抗体HLR降解卵巢癌标志物HE4。a）自噬抗体工作机制示意图。b）自噬抗体HLR降解卵巢癌细胞OVCAR3中的HE4。c）EdU细胞增殖实验显示HLR抑制OVCAR3细胞的增殖（蓝：Hoechst染色的细胞核；洋红色：EdU标记的S期细胞的细胞核）。

（四）纳米抗体型化学光遗传平台PANCID解析细胞信号转导

为实现对细胞进程的时空分辨调控，化学光遗传二聚化（chemo-optogenetic dimerization）利用光响应的化学诱导二聚化分子（pCID）实现了对细胞进程的高时间分辨和高空间分辨的调控。为进一步拓展化学光遗传工具箱，陈西课题组将纳米抗体与化学光遗传相融合，开发出纳米抗体型化学光遗传平台——光激活的小分子偶联纳米抗体二聚化系统PANCID（Adv. Sci., 2024, 11, e230754），用于时空分辨调控细胞进程。PANCID二聚化分子主要由三部分构成：光笼保护的甲氧苄啶配体、纳米抗体模块以及环十精氨酸细胞跨膜肽cR₁₀*。受益于纳米抗体的高亲和力、高特异性和可结合内源性蛋白的优势，使得该二聚化体系具有比经典化学光遗传二聚化体系更优越的特征，例如能诱导更强的二聚化，能实现方便的“无洗”（no-wash）光调控。此外，纳米抗体模块可以很容易地更换为不同的纳米抗体，进而使得PANCID具有模组化的特征和广泛的应用潜力。以PANCID为光调控工具，陈西课题组研究了细胞伪足的信号转导，发现细胞片状伪足信号轴相关的蛋白Tiam1和Rac1在信号轴中充当“分子振荡器”，能在快速或慢速激活下调控不同的下游通路，并诱发细胞凋亡。该研究相关成果发表在高影响力杂志Advanced Science 上，并被评选为封面文章。相应技术成果也获得国家发明专利授权。

图5. 光激活的小分子偶联纳米抗体二聚化平台PANCID。a）PANCID诱导剂的结构组成。b）Cys-TMP（Nvoc）的化学结构式。c）使用PANCID光照定位Rac1和Tiam1到细胞膜的示意图。d）光激活（PA）后Rac1迅速定位到细胞膜。e）光激活后很快形成细胞膜皱褶。f）光激活后Tiam1很快定位到细胞膜并伴随细胞膜起泡，同时免疫印迹WB显示凋亡因子caspase-3显著上调。g）Rac1或Tiam1的缓慢或快速的激活导致不同的细胞事件。

（五）深红光激活的化学诱导临近平台调控细胞进程

红光具有高穿组织穿透性、低光毒性、低光漂白性等优点，因此开发出红光响应的化学诱导临近体系具有重要价值。为此，陈西课题组设计了首个红光响应的化学诱导临近体系来诱导胞内蛋白的临近互作，进而光调控细胞生物学过程（Dyes Pigm., 2024, 223, 111973）。该课题中将红光响应的光笼dmBODIPY和被广泛使用的CIP分子脱落酸(+)-ABA共价连接而制备出深红光激活的化学诱导临近分子dmBODIPY-ABA。通过对细胞红光照射，dmBODIPY-ABA分子在细胞内光解，释放出游离二聚化分子(+)-ABA，进而诱导融合了ABI标签和PYL标签的两个蛋白二聚化。陈西课题组进一步运用这个红光激活临近诱导平台，将细胞凋亡因子Bax定位到线粒体外膜，实现红光诱导癌细胞的凋亡，相关研究成果发表在杂志Dyes and Pigments 上。此外，陈西课题组还设计了深红光激活的抗肿瘤免疫抑制剂（Cells, 2023, 12, 2351），开发出红光激活抗肿瘤免疫抑制剂芬戈莫德，实现红光照射下抑制小鼠移植瘤的生长。另外，该红光激活的免疫抑制剂搭配光敏剂亚甲基蓝可组成“AND”逻辑门控，能降低免疫抑制剂用量而进一步减少其可能的化学毒副作用。

图6. 深红光激活的化学诱导临近平台。a）红光激活CIP分子dmBODIPY-ABA和dfBODIPY-ABA的化学结构式。b）红光诱导蛋白二聚化示意图。c）dmBODIPY-ABA光解离的反应式。d）dmBODIPY-ABA的光分解和所释放(+)-ABA的生成曲线。e）深红光具有强组织穿透力。f）红光将Bax定位到线粒体膜而激活细胞凋亡，并使线粒体变圆同时产生孔洞。g）光照后细胞因凋亡而收缩。

以上为陈西研究员课题组近年来具有代表性的工作成果，其它更多详细信息请参考该课题组主页或“陈西课题组点评”公众号。课题组欢迎博士、硕士、本科生加入；同时课题组也长期开放助理研究员/副研究员、博士后、科研助理等岗位，欢迎对研究方向感兴趣的同学申请（PI邮箱：chenxihit@hit.edu.cn）。

陈西课题组主页：

https://homepage.hit.edu.cn/chenxi