基于USP7的去泛素化酶靶向嵌合体稳定AMPK

近年来，蛋白靶向水解技术包括分子胶（MGDs）、蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）、噬菌体靶向嵌合体（LYTACs）、蛋白水解靶向抗体（PROTAB）、细胞因子受体靶向嵌合体（KineTACs）、自噬小体绑定化合物（ATTEC）和自噬靶向嵌合体（AUTAC）等技术都已取得飞速发展。尤值得一提的是在蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）领域，目前已有数十种药物成功进入临床试验。然而对于某些疾病，一些蛋白质（例如肿瘤抑制蛋白）的低表达或突变导致的功能丧失是主要致病原因。因此稳定该类蛋白质是治疗相关疾病的新的方向，去泛素化酶靶向嵌合体（DUBTACs）技术逐渐兴起。该技术利用细胞内的去泛素化酶将目标蛋白去泛素化，进而升高蛋白水平，为相关疾病的治疗提供了新的希望。

目前，仅有基于去泛素化酶OTUB1的共价配体EN523的去泛素化酶靶向嵌合体(DUBTACs) 应用于稳定囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR） 肿瘤抑制转录因子FOXO，p53 和IRF。但是OTUB1的共价配体可能面临选择性差、毒性强等问题，发展新的可利用的去泛素化酶配体十分迫切。近日，金坚（Jian Jin）（点击查看介绍）和魏文毅 （Wenyi Wei）教授（点击查看介绍）团队通过分析USP7 的配体USP7i-#4a与USP7的共晶结构发现该配体结构中的伯胺基处于溶剂暴露区，可用于连接接头。随后他们通过不同长度的聚乙二醇（PEG）或碳链把USP7的配体1与CFTR的配体 Lumacaftor连接在一起，得到化合物1-13 （Figure 1A）。其中，7（MS6869）和13可有效稳定ΔF508-CFTR突变蛋白（Figure 1B）。随后，通过机理探究发现，MS6869可以在而不提高CFTR mRNA水平的基础上升高CFTR蛋白水平。接下来，作者通过内源性co-IP实验证实MS6869能够促进 USP7与CFTR形成三元复合物，有效地减少CFTR的泛素化水平，进而稳定CFTR（Figure 1C，D）。同时，MS6869能以浓度和时间依赖性方式升高CFTR的蛋白水平 （Figure 1E，F）。更重要的是，MS6869促进的CFTR蛋白提升主要发生在CFTR起功能作用的细胞膜上（Figure 1G）。在进一步的竞争实验中，USP7 或者CFTR的配体加入，都能影响了MS6869稳定蛋白的功能（Figure 1H）。同时，生物敲除USP7时也使MS6869丧失稳定蛋白的功能（Figure 1I）。以上的一系列的实验表明，MS6869稳定蛋白的功能是同时依赖于结合USP7和CFTR 的。作者也进行了串联质谱标签实验 (TMT)，实验结果表明MS6869可相对特异性地稳定CFTR （Figure 1J，K）。以上结果说明通过非共价抑制剂招募USP7应用于去泛素化酶靶向嵌合体技术（DUBTACs）的可行性。

Figure 1

为了进一步验证USP7在DUBTACs技术中的适用性，作者又合成了基于USP7的靶向AMP活化蛋白激酶 (AMPK) 的DUBTACs 14-25（Figure 2A）。该系列的双功能分子使用AMPK激动剂991结合AMPK的ADaM位点。值得注意的是：该位点位于AMPK激酶结构域的α亚单位和糖结合模块β亚单位的交界处，并且991可选择性激活AMPKβ1亚单元，而不是AMPKβ2亚单元。

当使用该系列化合物处理细胞后，作者发现22、23和24 （MS8118）均可稳定AMPKβ1，且不影响AMPKβ2和AMPK α的蛋白水平（Figure 2B）。其中MS8118可更加有效地增加AMPK下游底物乙酰辅酶a羧化酶（ACC）的表达（Figure 2C）。通过FLAG-IP实验证明MS8118的引入可有效促进USP7和AMPKβ1形成三元复合物（Figure 2D），降低AMPKβ1泛素化水平降低（Figure 2E）。在竞争实验中，USP7与AMPK配体的加入均可干扰MS8118的蛋白稳定能力（Figure 2F）。而敲除USP7后也可影响MS8118的蛋白稳定能力（Figure 2G）。这都表明MS8118的蛋白稳定能力依赖于与USP7和AMPK结合。作者随后考虑到稳定的AMPKβ1是否会影响细胞功能，又进行了Oil Red 染色实验来评估AMPKβ1在脂肪代谢中产生的影响。结果说明其中MS8118可明显减少Hela 细胞中脂肪堆积（Figure 2H）。在细胞克隆实验中，22、23和24（MS8118）均可抑制细胞克隆的形成，影响细胞生长（Figure 2I）。

随后，作者使用另一个USP7的非共价抑制剂GNE6776，合成了新系列的AMPK的DUBTACs化合物26-36（Figure 3A）。与MS8118结果不同的是，在该系列化合物中，55 (MS8655)、56 (MS8656) 和57 (MS8657) 可显著地稳定AMPKβ2，以及增加AMPK下游底物乙酰辅酶a羧化酶 (ACC)的蛋白表达, 且同时具有明显的浓度依赖性，但是对AMPKβ1仅有微弱的稳定作用（Figure 3B，C）。接下来，作者以其中的最优化合物MS8657进行了深入的机理探究。作者首先通过FLAG-IP实验发现了MS8657可以促进USP7和AMPKβ2之间可形成三元复合物（Figure 3D），以此减少AMPKβ2的泛素化水平（Figure 3E）。随后的竞争实验和敲除实验，其均证明USP7在去泛素化的过程中发挥了重要作用（Figure 3F，G）。最后进行了Oil Red 染色实验并发现55 (MS8655)、56 (MS8656) 和57 (MS8657) 均可干扰细胞脂质代谢（Figure 3H），同时抑制克隆实验中的细胞生长（Figure 3I）。

Figure 3

小结

在这项研究工作中，金坚和魏文毅教授团队拓展了靶向去泛素化酶嵌合体（DUBTACs）技术。他们以USP7作为去泛素化分子，实现了对CFTR和AMPK的蛋白稳定。同时，使用不同的USP7配体可以达到对靶标蛋白（AMPK）不同亚单位的选择性。值得一提的是，本文中使用的USP7配体都是USP7抑制剂，但是在实验中，以此配体招募的USP7还是能够有效的降低靶标蛋白的泛素化水平。虽然这其中的具体作用机理还亟待进一步研究，但是这个发现无疑极大地拓展了DUBTAC可利用的去泛素化酶的范围，为DUBTACs技术的进一步发展及作为潜在的疾病治疗手段奠定了基础。

相关工作近期发表于Journal of the American Chemical Society，共同第一作者为刘静博士、胡晓苹博士、罗开秀博士、熊彦博士和陈丽博士，通讯作者是金坚教授和魏文毅教授。

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USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK

Jing Liu, Xiaoping Hu, Kaixiu Luo, Yan Xiong, Li Chen, Zhen Wang, Hiroyuki Inuzuka, Chao Qian, Xufen Yu, Ling Xie, Adil Muneer, Dingpeng Zhang, Joao A. Paulo, Xian Chen, Jian Jin*, and Wenyi Wei*

J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c02373

导师介绍

金坚，著名药物化学家, 美国国家发明家科学院院士，美国西奈山医学院冠名教授，西奈山医疗发展中心主任, 西奈山伊坎医学院药理学系、肿瘤和神经科学系终身教授，帝势癌症研究所癌症临床研究项目共同负责人之一；本科毕业于中国科学技术大学；博士毕业于宾夕法尼亚州立大学，师从著名有机化学家Steven M. Weinreb。金坚教授具有二十多年的小分子药物研发经验，是治疗慢性肾病的上市药物Daprodustat开发者之一，在国际药物化学界享有盛誉。曾任葛兰素史克（GlaxoSmithKline）公司药物化学部门总监、北卡罗来纳大学教堂山分校药物化学部副主任等职。

金坚教授课题组的研究方向主要为：（1）组蛋白甲基转移酶选择性抑制剂的发现；（2）G蛋白偶联受体偏向性配体的开发；（3）靶向肿瘤蛋白新型降解剂的研制。迄今为止已在相关领域发表200余篇SCI论文，包括Nature, Science, Cell, Nat. Med., Nat. Rev. Drug Discov., Nat. Biotechnology, Nat. Chem. Biol., Nat. Reviews Cancer, Cancer Cell, Nat. Cancer, J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Sci. Adv., Nat. Commun., J. Med. Chem.等；受邀进行100余次演讲；申请美国及国际专利70余项。

https://www.x-mol.com/university/faculty/311500 

魏文毅，著名肿瘤生物学家，美国哈佛医学院终身教授，本科毕业于山东大学；博士毕业于美国布朗大学，师从John M. Sedivy教授；后于丹娜-法伯癌症肿瘤研究所诺贝尔获奖者William Kaelin教授实验室从事博士后研究助理工作。

魏文毅教授团队长期致力于肿瘤生物学的细胞周期调控机制及Akt/mTOR的翻译后修饰研究。现已在Science，Nature，Cell，Cancer Cell，Nature Cell Biology， Cancer Discovery，Molecular Cell，Nature Reviews Cancer等杂志发表上150余篇论文，引用超过14000次。

https://www.x-mol.com/university/faculty/311501