UCSB杨扬团队Nat. Chem.：重新设计和定向进化脂肪酸光脱羧酶实现立体发散性自由基环化反应

作为一类非常稀有的天然酶功能，天然存在的光酶是一类引人关注的酶家族，需要稳定的光源才可参与催化反应。与先前研究的天然光酶（如：原叶绿素酸酯氧化还原酶、DNA光修复酶）相比，藻类衍生的脂肪酸光脱羧酶（fatty acid photodecarboxylases，FAPs）可以吸收和利用蓝光催化脂肪酸脱羧，其中黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅基能够通过自由基机制对廉价易得的羧酸进行有效的光脱羧反应。虽然研究者对脂肪酸光脱羧酶的工程化改造进行了深入的研究，但这些工作主要集中于扩大其天然反应的底物范围上。对脂肪酸光脱羧酶的非天然反应性（new-to-nature reactivity）的研究处于空白状态。另一方面，由于对自由基中间体进行立体控制的困难，实现催化不对称自由基转化一直是化学家面临的一项艰巨任务。相比之下，通过天然酶的重新设计（repurposing）和工程化改造来催化涉及非天然自由基反应，进行不对称催化，是一种很有前景的策略。

美国加州大学圣巴巴拉分校（UCSB）的杨扬教授课题组致力于生物催化的不对称反应以及天然产物的化学酶法合成。近日，杨扬教授和UCSB海洋科学系Dave Valentine教授以及美国匹兹堡大学的刘鹏教授合作，通过对天然脂肪酸光脱羧酶FAPs的基因组挖掘、理性设计和定向进化，开发了一组非天然自由基光环化酶RAPs，并以优异的化学选择性、对映选择性和非对映选择性实现了脱羧自由基环化反应（图1）。其具体过程如下（图1a）：首先，FAD在可见光激发下产生强氧化性黄醌FAD_q*，与羧酸盐底物I进行单电子转移，然后快速脱羧获得烷基自由基III和黄素半醌FAD^•−（FAD_sq）。接着，亲核烷基自由基物种与侧链的α,β-不饱和羰基进行加成并得到一个新的碳中心自由基IV。最后，IV与FAD^•−和氨基酸残基进行电子转移/质子转移（ET/PT）或质子耦合电子转移（PCET），立体选择性地生成产物并再生FAD辅因子，从而完成催化循环。此外，作者还改造出一组正交的自由基光环化酶以实现立体发散性自由基环化并获得四种可能的立体异构体（图1c），同时分子动力学模拟表明进化的自由基光环化酶可以轻松获得近攻击构象，从而实现化学选择性自由基环化。相关成果发表在Nature Chemistry 上。

图1. 重新设计和定向进化FAPs作为新的立体选择性RAPs。图片来源：Nat. Chem.

鉴于靶向5-exo-trig自由基环化在动力学上更有利，因此作者选择α,β-不饱和酯-羧酸底物1a的对映选择性脱羧自由基环化反应进行研究。除了天然脱羧光酶反应中广泛研究的CvFAP外，作者还建立了FAP同源蛋白库以鉴定和开发有效的立体选择性RAPs（图2a），同时使用蛋白质骨架将底物1a导向自由基环化的近攻击构象，进而能够有效抑制光激发FAD_q*与光酶脱羧形成的碳中心自由基发生过早的PCET终止过程。如图2b所示，作者进行了定点突变以获得所有FAP同源物的CvFAP Y466A和类似的酪氨酸-丙氨酸突变体，并测试了它们的催化活性，结果显示CvFAP能以0.5%的产率和42:58 e.r.值获得自由基环化产物2a，而近头状尖胞藻FAP（RsFAP）与CvFAP的对映选择性互补，进而凸显出FAPs基因组挖掘的价值。进一步研究发现用丙氨酸取代466（Y466）处的酪氨酸残基导致总活性至少提高了三倍。随后，作者进行定向进化以提高FAPs衍生RAPs的活性、化学选择性和对映选择性（图2c），并且该过程可以以96孔板形式进行高通量实验。值得一提的是，进化的CvFAP^AAGAA（CvRAP₁）能以91%的产率、96:4 e.r.值和95:5的化学选择性获得自由基环化产物2a；而CvFAP^AAAAA（CvRAP₂）能以92%的产率、94:6 e.r.值和96:4的化学选择性获得产物2a。在这些突变体中，G462A在提高化学选择性方面发挥着重要作用，并且有益突变体G462A、S464A和Y466A都位于底物附近的461-472 α-螺旋中，这种α-螺旋在调节酶活性中起着关键作用。

图2. 反应条件优化。图片来源：Nat. Chem.

在最优条件下，作者对光酶催化自由基环化反应的底物范围进行了考察（图3）。结果显示α,β-不饱和乙酯（2a）、甲酯（2b）、正丙酯（2c）、2-溴乙酯（2d）和内酯（2e）以及α-卤素（2f-2h）/乙基（2i）取代的α,β-不饱和酯甚至α,β-不饱和酰胺（2j）和α,β-不饱和酮（2k）均能兼容该反应，以中等至优异的产率和对映选择性获得相应的环化产物，不过2j的产率较低（12%）、2k是外消旋的。值得一提的是，该反应还可以实现6-exo-trig光酶催化环化反应并以中等至良好的产率和优异的对映选择性获得各种六元环化产物（2l-2o）。

图3. 底物拓展。图片来源：Nat. Chem.

接下来，作者进一步工程化改造RAPs以立体发散方式在α和β位构建两个连续立体中心，该过程需要光环化酶对C-C键形成自由基环化步骤和随后的质子转移步骤精细控制。如图4所示，CvRAP₂（CvFAP^AAAAA）经过三轮定点饱和突变后得到CvRAP₂（G431W/I130F/A131V）（CvRAP₃），后者能够有效催化底物1p 并以83%的产率、90:10 d.r.值和>99:1 e.r.值获得产物(2S,3R)-2p。此外，对1p光生物催化环化的CvRAP₂进化谱系的评估显示中间变体CvFAP^AAAA（CvFAP（Y466A/G462A/S574A/S464A））和最终变体CvFAP^AAAAA显示出相似的非对映选择性和对映选择性，因此作者选择CvFAP^AAAA作为起始变体进行定向进化和蛋白质工程，结果显示CvFAP^AAAA（T465S/T131S）（CvRAP₄）能以86%的产率、20:80 d.r.值和>99:1 e.r.值获得产物(2S,3S)-2p。类似地，CvRAP₄通过迭代定点饱和突变筛选获得CvRAP₄（A466F/S465M/V463A）（CvRAP₅），其能以55%的产率、59:41 d.r.值和90:10 e.r.值获得α-位立体化学相反的产物(2R,3S)-2p；而CvFAP^AAAA（I130F/T484S/V463N）（CvRAP₆）则能以89%的产率、78:22 d.r.值和96:4 e.r.值获得第四个立体异构体(2R,3R)-2p。类似的完全立体发散性自由基环化在经典有机化学和酶催化的不对称自由基反应中都未见报道。

图4. 立体发散性不对称自由基环化反应的定向进化。图片来源：Nat. Chem.

值得一提的是，CvRAP₆还能够有效催化1a的环化反应并以86%的产率、25:75 e.r.值获得立体化学相反的产物(R)-2a（图5a），这意味着CvRAP₁和CvRAP₆共同构成了一组正交的生物催化剂，可实现具有单个立体中心环化产物的对映发散性合成。另外，四取代烯烃1q在CvRAP₅的催化下可以转化为含有季碳的手性产物2q（产率：51%、e.r.值：97:3，图5b）。在研究过程中，作者发现(E)-和(Z)-烯烃几乎以相同的产率和对映选择性进行转化获得相同的主要对映体产物，从而允许α,β-不饱和底物以E/Z混合物的形式进行立体汇聚式转化。为了进一步研究这种立体汇聚式光生物转化的性质，作者首先评估了(E)-和(Z)-1a在游离FAD存在下用蓝光照射的光活性，结果显示(E)-1a在游离FAD存在下双键构型保持不变，并且不发生脱羧自由基环化；而(Z)-1a发生Z/E异构化，并且光化学平衡态下得到(E)-1a。而使用改造的光脱羧环化酶CvRAP₁时，(E)-1a没有观察到烯烃异构化；(Z)-1a观察到立体化学变化并在回收的1a中存在显著量的(E)-1a。总之，这些结果表明在光化学条件下，工程化光酶CvRAP₁和游离的FAD辅因子都可以催化(Z)-1a的烯烃异构化，但不催化(E)-1a的烯烃异构化。值得一提的是，作者还使用CvRAP₁比较了光生物催化(E)-1a和(Z)-1a脱羧自由基环化的初始速率，结果显示尽管(Z)-1a在可见光照射下异构化为(E)-1a，但是(Z)-1a转化为环化产物2a的速率大约是(E)-1a的两倍。此外，作者还进行了经典分子动力学（MD）模拟以探索光酶催化1a脱羧形成烷基自由基4a的构象空间，以进一步探究CvRAP₁的化学选择性。工程化改造的光酶相比野生型天然光酶，通过底物构象的调整，可以更高效地促进自由基环化，从而抑制该光酶的天然功能。

图5. 合成应用。图片来源：Nat. Chem.

图6. 酶活性位点内自由基环化的MD模拟。图片来源：Nat. Chem.

总结

杨扬教授团队通过对天然脂肪酸光脱羧酶FAPs的基因组挖掘、理性设计和定向进化，开发了一组非天然自由基光环化酶RAPs并以优异的化学选择性、对映选择性和非对映选择性实现了脱羧自由基环化反应；同时还改造出一组正交的自由基光环化酶以实现立体发散性自由基环化并获得四种可能的立体异构体。该研究成果为天然光酶家族提供了非天然的C-C键形成活性，可用于控制自由基介导反应的立体化学选择性。

杨扬教授团队长期致力于生物催化、酶工程和有机化学的研究，欢迎有志于在有机化学和生物催化交叉的前沿领域进行研究的研究生和博士后申请研究职位。具体信息请参见https://yang.chem.ucsb.edu/  ，欢迎感兴趣的同学和杨扬教授联系。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Stereodivergent photobiocatalytic radical cyclization through the repurposing and directed evolution of fatty acid photodecarboxylases

Shuyun Ju, Dian Li, Binh Khanh Mai, Xin Liu, Alec Vallota-Eastman, Jianping Wu, David L. Valentine, Peng Liu, Yang Yang

Nat. Chem., 2024., DOI: 10.1038/s41557-024-01494-0

导师介绍

杨扬

https://www.x-mol.com/university/faculty/369148

刘鹏

https://www.x-mol.com/university/faculty/1732

（本文由吡哆醛供稿）